Pełny opis metody reakcji łańcuchowej polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest tworzeniem wielu kopii krótkiego odcinka ludzkiego DNA. Niewielka ilość materiału fizjologicznego jest niezbędna do badań i uzyskania wyników: plwociny, krwi, płynu owodniowego, śliny, moczu itp.

Czym jest reakcja łańcuchowa polimerazy?

Metodę PCR opracował amerykański naukowiec Melison, który w 1998 r. Otrzymał Nagrodę Nobla za rozwój. Aktywnie używane:

  • z wczesną diagnozą infekcji, patologii onkologicznych;
  • w badaniu kryminalistycznym do badania niezwykle małej ilości DNA;
  • w medycynie weterynaryjnej, biologii, genetyce molekularnej;
  • do osobistej identyfikacji przez DNA;
  • potwierdzić ojcostwo;
  • w ekologii, na przykład, gdy śledzimy jakość produktu, w antropologii.

Kto przepisuje PCR?

Reakcja łańcuchowa polimerazy w diagnostyce patologii zakaźnych jest jedną z najbardziej niezawodnych metod, która zapewnia najbardziej dokładną i wiarygodną analizę. Na przykład wiarygodność analizy chlamydii jest bliska 100%. Najczęściej ten środek diagnostyczny jest przepisywany pacjentom, którzy podczas testu mają trudności z identyfikacją konkretnego patogenu.

Zastosowano testy laboratoryjne PCR:

  1. Aby wyszukać organizmy chorobotwórcze, które powodują zakażenie dróg moczowych i płciowych, trudno jest określić, kiedy stosuje się uprawy lub metody immunologiczne.
  2. Do ponownej analizy HIV na początkowym etapie z pozytywnym, ale wątpliwym wynikiem wstępnej analizy, na przykład u noworodków z zakażonych rodziców.
  3. Ustalenie patologii onkologicznej na wczesnym etapie i indywidualnej korekty schematu leczenia u pacjentów.
  4. Do wczesnego wykrywania i potencjalnego leczenia dziedzicznych patologii. Wielu przyszłych rodziców bada, czy są nosicielami chorób genetycznych. U dzieci metoda ta określa prawdopodobieństwo narażenia na choroby dziedziczne.

Również ta technika jest używana:

  • do wykrywania patologii płodu we wczesnej ciąży;
  • u pacjentów przed operacją przeszczepu narządu - konieczne do określenia zgodności tkanek
  • do wykrywania niebezpiecznych patogenów we krwi dawcy;
  • u noworodków do wykrywania ukrytych infekcji;
  • ocena wyników leczenia przeciwwirusowego lub przeciwbakteryjnego.

Po co przechodzić przez tę procedurę?

Ponieważ PCR jest uważana za wysoce skuteczną metodę diagnostyczną, która daje prawie 100% wyniki, ta procedura jest stosowana:

  1. Aby potwierdzić lub wykluczyć diagnozę.
  2. Szybka ocena skuteczności leczenia.
  3. W wielu przypadkach ta metoda jest uważana za jedyny możliwy sposób wykrywania rozwijającej się patologii, jeśli inne techniki bakteriologiczne i wirusologiczne okazały się bezużyteczne.
  4. Wirusy wykorzystujące procedurę PCR są wykrywane natychmiast po infekcji i przed wystąpieniem głównych objawów.
  5. Wczesne wykrycie mikroorganizmów pozwoli na szybkie leczenie.

Ponadto analiza PCR pozwoli szybko wykryć niewielką liczbę mikroorganizmów w żywych lub martwych próbkach. Dlatego ta technika jest stosowana do poszukiwania określonego organizmu patogennego, na przykład prątka gruźlicy.

Ponadto stosuje się analizę PCR:

  • określenie wrażliwości DNA na określone rodzaje antybiotyków, które pozwolą jak najszybciej rozpocząć leczenie;
  • kontrolować rozprzestrzenianie się epidemii;
  • identyfikować i śledzić nowe rodzaje drobnoustrojów, patogenów.

Główne typy PCR

Metoda standardowa

Analizę PCR przeprowadza się na podstawie wielokrotnego podwojenia konkretnego fragmentu DNA i RNA przy użyciu enzymów starterów. Dzięki temu badacz otrzymuje wymaganą ilość materiału.

PCR w czasie rzeczywistym

W tego typu badaniach proces identyfikacji danego fragmentu rozpoczyna się po przejściu każdego cyklu. Ten rodzaj badań pozwala uzyskać informacje na temat liczby wirusów i mikroorganizmów w organizmie, czyli przeprowadzić analizę ilościową.

Tryb odwrotnej transkrypcji z PCR

Analiza ta służy do wyszukiwania jednoniciowego RNA do dalszego wykrywania wirusów, których baza genetyczna nosi nazwę RNA. Na przykład jest to wirus zapalenia wątroby typu C, niedobór odporności i tak dalej. Przeprowadzając to badanie, stosuje się specjalny enzym, dzięki któremu powstaje jednoniciowy DNA. Następnie system przywraca drugą nić DNA i wykonuje tradycyjną procedurę.

Wskazania dla

Procedura PCR jest stosowana w klinikach chorób zakaźnych, położnictwa, urologii, ginekologii i nefrologii, pediatrii i tak dalej. Najczęstsze wskazania do analizy przypisania są następujące:

  • określenie ryzyka rozwoju nieprawidłowości genetycznych u dziecka w obecności dziedzicznych patologii;
  • zdiagnozować oboje rodziców podczas planowania ciąży lub gdy matka jest w ciężkim stanie podczas noszenia dziecka;
  • z trudnościami w poczęciu w celu zidentyfikowania przyczyn niepłodności;
  • w przypadku podejrzenia zakażeń seksualnych w ostrej fazie lub zagrożonych przejściem do stadium przewlekłego;
  • do wykrywania przyczyn procesów zapalnych nieznanego pochodzenia;
  • z niezabezpieczonym swobodnym seksem;
  • określenie wrażliwości patogennego mikroorganizmu na określony lek;
  • podejrzewana infekcja utajona w celu wykrycia patogenów bez oczywistych objawów;
  • potwierdzić powrót do zdrowia po chorobie, czyli retrospektywnej diagnozie.
Ponadto PCR stosuje się, gdy konieczne jest dokładne zidentyfikowanie takich patogenów, jak: wirusy zapalenia wątroby, ludzki niedobór odporności, wirus cytomegalii, wirus opryszczki zwykłej, wirus różyczki, wirus brodawczaka.

Metoda ta jest stosowana do określania zakażeń: mononukleozy zakaźnej, kleszczowego zapalenia mózgu, kandydozy, która jest wywoływana przez grzyby Candida, zakażenia narządów płciowych i gruźlicę.

Jeśli przeciwwskazania i bezpieczna metoda?

Ponieważ procedura ta jest przeprowadzana bez wpływu na organizm i używany jest tylko materiał biologiczny, który jest pobierany do badań, nie ma przeciwwskazań z powodu braku potencjalnego zagrożenia dla organizmu. Na przykład, pobieranie próbek biomateriału z kanału szyjki macicy nie jest przeprowadzane po kolposkopii. Rozmaz dostawy, skrobanie jest dozwolone tylko 4-7 dni po zakończeniu miesiączki i całkowitym zaprzestaniu wypisywania.

Cechy przygotowania do procedury

Jako próbkę do analizy PCR, w której wykryto DNA obcego patogenu, stosuje się płyn biologiczny lub tkankę. Przyjmowanie badanej substancji odbywa się w formie pobierania krwi z żyły, skrobania z jamy nosowej, krtani, szyjki macicy, cewki moczowej. Przed procedurą diagnostyczną lekarz musi wyjaśnić pacjentowi, jakie materiały zostaną pobrane:

  • w analizie zakażeń opryszczką mononukleoza dokonuje analizy moczu, a także wymazu z gardła;
  • podczas badania na zapalenie wątroby lub toksoplazmozę krew pobierana jest z żyły;
  • w celu zdiagnozowania różnych rodzajów uszkodzenia OUN, pobierany jest płyn mózgowo-rdzeniowy;
  • w pulmonologii próbki do analizy PCR to płyn opłucnowy i plwocina;
  • jeśli przeprowadzi badanie zakażeń wewnątrzmacicznych podczas ciąży, płyn owodniowy, komórki łożyska są wykorzystywane do analizy.

Niezawodność i dokładność wyniku zależy od sterylności i warunków pobierania biomateriału. Ponieważ badania PCR są bardzo wrażliwe, każde zanieczyszczenie pobranej substancji może zniekształcić wyniki. Kompetentny preparat do dostarczania biomateriału nie stanowi dla pacjenta żadnych trudności.

Istnieje jednak kilka zaleceń:

  • analizując infekcje przenoszone drogą płciową, konieczne jest wykluczenie kontaktów intymnych na trzy dni przed dostarczeniem materiału;
  • 72 godziny powinny przerwać stosowanie preparatów dopochwowych;
  • od wieczora poprzedniego dnia nie można przeprowadzać higieny badanych obszarów;
  • 3-4 godziny przed pobraniem próbki z cewki moczowej należy wykluczyć oddawanie moczu;
  • miesiąc przed podjęciem testów należy przerwać przyjmowanie antybiotyków;
  • krew podaje się rano na pusty żołądek przed jedzeniem i piciem;
  • Poranny mocz zbiera się w sterylnym pojemniku po przejściu do toalety.

Jak jest PCR?

Podczas przeprowadzania badań w specjalnym reaktorze powtarza się pewien cykl:

  1. Pierwszy krok. Denaturacja. Ślina, krew, testy ginekologiczne i inne substancje są umieszczane w aplikatorze, gdzie materiał jest podgrzewany, a DNA jest dzielony na dwa łańcuchy.
  2. Drugi krok. Nieznaczne ochłodzenie podjętej substancji, dodając do niej specjalne składniki, które rozpoznają niezbędne części cząsteczki DTC i wiążą się z nią.
  3. 3 krok. Wydłużenie Podczas procesu kończy się fragment DTC patogennego organizmu, tworzy się jego kopia. Cykl ten powtarza się, co podwaja kopię określonego fragmentu DNA.

W ciągu kilku godzin powstaje wiele kopii tego fragmentu, ujawnia się ich obecność w próbkach. Następnie wyniki są porównywane z bazami danych różnych typów patogenów. Pozwala to określić rodzaj infekcji.

Cechy analizy dekodowania?

Ostateczny wynik badania zostanie podany pacjentowi kilka dni po analizie biologicznej.

Analiza jakościowa

Wynik negatywny w tym przypadku oznacza, że ​​nie wykryto żadnego czynnika zakaźnego w płynie, który został przedłożony do badania. Pozytywny wynik wskazuje na wykrycie patogennych wirusów lub bakterii w próbce biologicznej. Jeśli wynik był pozytywny, ale jednocześnie osoba nie ma oznak aktywacji zakażenia, taki stan organizmu nazywany jest bezobjawowym zdrowym nosicielem.

Najczęściej obserwuje się to podczas przyjmowania biomateriału w patologiach wirusowych. W takim przypadku leczenie nie jest wymagane, ale wymaga stałego nadzoru medycznego. Ponieważ w takich warunkach istnieje prawdopodobieństwo:

  • rozprzestrzenianie się wirusa z nosiciela na zdrowych ludzi;
  • aktywacja procesu i przejście patologii do postaci przewlekłej.

Analiza ilościowa

Wynik ilościowy jest ustalany przez specjalistę specjalnie dla konkretnego rodzaju zakażenia. Na podstawie uzyskanych wyników można ocenić stopień rozwoju, etap patologii, który umożliwia przepisanie leczenia tak szybko, jak to możliwe.

Obejrzyj film: Metoda PCR w czasie rzeczywistym - istota metody, optymalizacja reakcji (Marzec 2024).